Questa tesi si è prefissa due scopi: studiare il possibile ruolo protettivo dell’antiossidante lipofilo BHT contro la degradazione di β-carotene in diversi oli e in condizioni di alte temperature; analizzare l’evoluzione del profilo in acidi grassi e dello stato ossidativo di due tipologie di olio (olio di cocco e olio di girasole), mantenuti a elevate temperature in presenza degli antiossidanti β-carotene e BHT, singoli o in combinazione.  Vediamo quanto emerso.

Yana Madonna – Tesi di Laurea Magistrale in Scienze e Tecnologie Alimentari  (Ottobre 2024) – Università Cattolica del Sacro Cuore – docente relatore Giorgia Spigno (yana.madonna@unicatt.it; giorgia.spigno@unicatt.it); University of Reading (UK) – docente relatore Maria Josè Oruna Concha (m.j.oruna-concha@reading.ac.uk).

Gli oli vegetali sono un ingrediente fondamentale nella lavorazione di diversi prodotti alimentari, poiché modificano le materie prime e gli ingredienti con cui vengono utilizzati, aumentando il contenuto calorico, e modificando la sensorialità dei prodotti finiti in maniera differente in funzione dei processi di lavorazione. Uno dei metodi più utilizzati e antichi al mondo per la preparazione degli alimenti è la frittura, che avviene a temperature elevate. Proprio a causa delle alte temperature raggiunte durante la frittura, si verificano una serie di reazioni complesse come idrolisi, ossidazione e polimerizzazione che porta alla formazione di diversi prodotti tra qui gli idroperossdi.

Questi ultimi si decompongono dando origine a prodotti secondari come esteri, aldeidi, alcoli, chetoni, lattone e idrocarburi. La formazione di questi prodotti secondari comporta una perdita del valore nutrizionale e la generazione di composti che influenzano il sapore. Per prevenire e rallentare queste reazioni, vengono utilizzati differenti antiossidanti di sintesi come il BHT (butilidrossitoluene) con lo scopo di preservare anche altre molecole che si trovano negli oli vegetali. In alcuni oli vegetali è presente un pigmento che conferisce colore arancione: il β-carotene.

Questa molecola si degrada in presenza di luce e calore e viene quindi persa nei processi di raffinazione degli oli. Il β-carotene è ampiamente utilizzato come colorante naturale e conservante nell’industria alimentare. Ciò è dovuto alle sue proprietà antiossidanti, che lo rendono capace di proteggere dai danni causati da altre molecole, come i radicali liberi. Il β-carotene, inoltre, essendo una provitamina, può essere consumato per compensare la carenza di vitamina A che rappresenta un grave problema di salute pubblica a livello globale, in particolare in Asia e Africa.

Scopo

Gli obiettivi di questo lavoro di tesi sono stati: (1) studiare la cinetica di degradazione del β-carotene in alcuni oli da cucina commercialmente disponibili alle temperature di frittura (180°C) nel tempo (fino a 30 minuti); (2) investigare l’effetto del BHT nella prevenzione della degradazione del β-carotene in tali condizioni. Sono stati analizzati cinque oli da cucina commerciali: olio di oliva, olio extravergine di oliva, olio di colza, olio di girasole e olio di cocco, sottoposti a condizioni di frittura. Sono state effettuate analisi del contenuto in β-carotene, nonché la determinazione dei valori di acidità e di perossidi e del profilo degli acidi grassi liberi negli oli trattati.

Materiali e metodi

Per il piano sperimentale sono stati utilizzati cinque campioni commerciali di oli vegetali (olio di oliva, olio extravergine di oliva, olio di colza, olio di girasole e olio di cocco), sottoposti a condizioni di frittura. Gli oli sono stati portati alla temperatura di 180°C, poi, sono state aggiunte soluzioni di β-carotene alla concentrazione di 0.01% o di BHT alla concentrazione di 0.02% o una miscela delle due soluzioni di β-carotene e BHT.

Successivamente sono state prelevate delle aliquote a intervalli di 0, 5, 10, 20, 25 e 30 minuti, raffreddate immediatamente in un bagno di ghiaccio per impedire e rallentare la degradazione del β-carotene e analizzate per:

• Livelli di β-carotene, mediante metodo spettrofotometrico con lettura dell’assorbanza a 450 nm e costruzione di opportune curve di calibrazione.
• Valore di acidità, seguendo la norma ISO 660:2020.
• Valore dei perossidi, seguendo il metodo ufficiale modificato della American Oil Chemists’ Society, (AOCS Official Method Cd 8b-90).
• Acidi grassi liberi, tramite cromatografia gassosa con rivelatore a ionizzazione di fiamma. Un campione di olio (0.1 g) è stato miscelato con esano e trattato con una soluzione di idrossido di potassio metanolico (2 M), separando il glicerolo. I metil esteri degli acidi grassi (FAMEs) sono stati estratti e analizzati con GC, con una colonna capillare BPX-70. La composizione degli acidi grassi è stata determinata in base all’area dei picchi dei FAMEs e curve di calibrazione con standard per potere calcolare i contenuti in acidi grassi saturi (SAF) monoinsaturi (MUFA), e polinsaturi (PUFA).

Gli andamenti della concentrazione di β-carotene sono stati interpretati con un modello cinetico di ordine primo per calcolare la costante cinetica di degradazione dei diversi oli con o senza aggiunta di antiossidanti. Tutte le analisi sono state effettuate in triplicato. I valori riportati sono i valori medi con relative deviazioni standard.

Le differenze tra i campioni sono state valutate mediante un’analisi della varianza a due vie considerando l’effetto del β-carotene, del BHT e dell’interazione tra i due sui livelli degli acidi grassi nel campione (ANOVA) e test Post-Hoc di Tukey, con un livello di confidenza del 95% (XLSTAT Statistics Software 2024.2.2).

Risultati

La Figura 1 mostra l’andamento dei livelli di β-carotene nel tempo, in presenza o assenza dell’antiossidante BHT, in diversi oli da cucina commerciali a 180°C. Le concentrazioni sono riportate come logaritmo naturale della concentrazione normalizzata rispetto alla concentrazione iniziale, in accordo con un modello cinetico di ordine primo.

Per tutti gli oli, indipendentemente dalla presenza o assenza di BHT, si osserva una significativa diminuzione (p < 0.05) dei livelli di β-carotene nel tempo a questa temperatura di frittura. Questo comportamento dimostra che, nel complesso, il BHT non ha un effetto protettivo contro la degradazione del β-carotene. Questo comportamento è probabilmente dovuto alla bassa resistenza del BHT a temperature superiori a 140°C.

La Figura 1 mostra un comportamento molto simile per gli oli liquidi (prevalentemente insaturi) a temperatura ambiente (oliva, girasole e colza), con valori della costante cinetica k di ordine primo che variano da 0.0004 s^-1 nell’olio di colza a 0.0008 s^-1 nell’olio d’oliva. L’olio di cocco, invece, con un elevato contenuto di grassi saturi, presenta un comportamento completamente diverso, con una k di 0.0021 s^-1 in assenza di BHT e 0.0019 s^-1 in presenza di BHT.

Questi valori indicano che il β-carotene si degrada molto più rapidamente in questo olio rispetto agli altri oli. Questo comportamento differente e, di conseguenza, la diversa degradazione del β-carotene sono dovuti alla diversa composizione degli oli. In particolare, l’olio di cocco è composto per il 96% da acidi grassi saturi, mentre l’olio di girasole è composto per l’86.8% da acidi grassi polinsaturi, con la restante frazione distribuita tra monoinsaturi e saturi. Il β-carotene si degrada con il calore principalmente a causa dell’instabilità dei suoi doppi legami coniugati con reazioni di ossidazione termica che portano alla formazione di prodotti di degradazione e perdita di colore.

Questi fattori riducono l’efficacia del β-carotene come antiossidante e possono alterarne le proprietà nutrizionali e chimiche. Dopo l’analisi iniziale degli oli, sono stati selezionati due oli per ulteriori analisi a causa dei loro comportamenti molto differenti, olio di cocco e olio di girasole, per valutarne valore di acidità e perossidi. Il valore di acidità e il valore di perossidi sono parametri comunemente valutati come indicatori della qualità ossidativa degli oli.

È stato osservato un aumento del valore di acidità per tutti i campioni passando da 0.15 mg_KOH/g (al tempo 0) a 0.31 mg_KOH/g (a 30 minuti) mostrando una significativa differenza tra i valori di acidità del campione di olio di cocco (0.31 mg_KOH/g) e del campione con β-carotene e BHT (0.22 mg_KOH/g). In particolare, l’olio di cocco con aggiunta di BHT presentava la stessa acidità dell’olio di cocco da solo, con valori di 0.29 mg_KOH/g e 0.31 mg_KOH/g rispettivamente, ed è superiore rispetto ai valori di acidità ottenuti per i campioni arricchiti con β-carotene o con β-carotene e BHT, aventi rispettivamente i valori di 0.26 mg_KOH/g e 0.23 mg_KOH/g.

Per quanto riguardo il numero di perossidi, si è osservato un aumento dei valori per tutti i campioni in seguito al riscaldamento passando da 70 meq_O2/kg a 170 meq _O2/kg nei 30 minuti analizzati. I livelli di perossidi dell’olio di cocco (170 meq_O2/kg) sono però risultati statisticamente uguali a quelli dei campioni di olio di cocco arricchiti con BHT (160 meq_O2/kg) dimostrando che il BHT non ha avuto un effetto antiossidante nei campioni. I campioni arricchiti con β-carotene, o con β-carotene e BHT hanno mostrato valori inferiori di circa il 30% rispetto all’olio tal quale (120 meq_O2/kg e 130 meq_O2/kg, rispettivamente).

Quindi, il BHT non ha avuto un effetto antiossidante, mentre il β-carotene ha determinato la riduzione dei perossidi nei campioni analizzati. Nell’olio di girasole per tutti i campioni si è osservato un aumento statisticamente significativo del valore di acidità alla temperatura di 180°C, ma senza differenza statisticamente significativa tra i campioni con o senza  antiossidanti, con i livelli variabili da 0.25 mg_KOH/g a 0.35 mg_KOH/g. I valori di perossidi sono aumentati significativamente per tutti i campioni senza però differenze significative legate all’aggiunta di  β-carotene e/o BHT che presentavano valori di 60 meq_O2/kg e 70 meq_O2/kg rispettivamente.

La Figura 2 riporta i valori degli acidi grassi monoinsaturi (MUFA) in olio di cocco e olio di girasole prima e durante riscaldamento a 180°C sino a 30 min, senza o con aggiunta di β-carotene, β-carotene + BHT o BHT. Gli stessi andamenti sono stati ottenuti per gli acidi grassi saturi (SFA) e polinsaturi (PUFA) che però non sono stati riportati in questo documento. Nel caso di olio di cocco, si è osservato un aumento della percentuale di acidi grassi saturi (SFA) dopo il raggiungimento della temperatura di 180°C però i valori di MUFA e di PUFA sono diminuiti rispetto all’olio iniziale a temperatura ambiente, per poi ridursi durante il riscaldamento.

Confrontando i diversi trattamenti, la coppia di campioni di solo olio di cocco e olio con BHT ha mostrato lo stesso andamento: aumento di SFA e diminuzione di MUFA e PUFA. Nella coppia di campioni di olio di cocco arricchito con β-carotene e con β-carotene + BHT, si è osservato analogamente lo stesso comportamento tra esse. Si evince che nei campioni in cui era presente il β-carotene i cambiamenti dei livelli di SFA, MUFA e PUFA erano minori se confrontati con l’olio crudo.

Questo indica che il BHT non ha alcun effetto antiossidante significativo, perdendo la sua efficacia a temperature elevate. Tuttavia, il β-carotene ha dimostrato un effetto antiossidante statisticamente significativo, proteggendo contro l’ossidazione termica. Inoltre, non si riscontra alcuna interazione positiva tra β-carotene e BHT, poiché i campioni con i due antiossidanti aggiunti singolarmente hanno mostrano lo stesso comportamento in termini di SFA, MUFA e PUFA a 180°C.

Relativamente all’olio di girasole a temperatura ambiente e dopo il raggiungimento e mantenimento della temperatura di180°C da 0 a 30 min, l’analisi  dei dati ha mostrato un aumento della percentuale di SFA, senza però differenze statisticamente significative tra i diversi trattamenti, indicando che il β-carotene e il BHT non hanno avuto effetti antiossidanti nell’olio di girasole.

Conclusioni

Uno degli obiettivi della ricerca era studiare il possibile ruolo protettivo dell’antiossidante lipofilo BHT contro la degradazione di β-carotene in diversi oli e in condizioni di alte temperature (come in un processo di frittura), dato il ruolo nutrizionale del β-carotene. Si è osservato che il BHT, a 180°C, non riesce a svolgere un effetto protettivo sulla degradazione del β-carotene perdendo la sua efficacia.

Inoltre, la degradazione del β-carotene nei vari oli sembra dipendere dalla loro composizione in acidi grassi, risultando più rapida nell’olio di cocco, ricco di acidi grassi saturi, rispetto all’olio di girasole, ricco di acidi grassi polinsaturi. Probabilmente l’ossidazione degli acidi grassi insaturi compete cineticamente con l’ossidazione del β-carotene che si ritrova ad essere, invece, il substrato principale per l’ossidazione nell’olio di cocco.

Un altro obiettivo della ricerca è stato quello di analizzare l’evoluzione del profilo in acidi grassi e dello stato ossidativo di due tipologie di olio (olio di cocco e olio di girasole), mantenuti a elevate temperature in presenza degli antiossidanti β-carotene e BHT, singoli o in combinazione.  In entrambi gli oli si è osservata una riduzione degli acidi grassi saturi e un aumento degli acidi grassi monoinsaturi e polinsaturi e solo il β-carotene ha mostrato effetti positivi nel contrastare (limitatamente) l’ossidazione nell’olio di cocco che ha un minor contenuto di acidi grassi insaturi da proteggere dall’ossidazione. Purtroppo, anche il β-carotene, tende a degradarsi rapidamente a 180°C, perdendo le proprietà antiossidanti.